Diagnostyka mikrobiologiczna – metody klasyczne vs „nowoczesne”

Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń bakteryjnych służy identyfikacji drobnoustrojów chorobotwórczych, w tym wypadku bakterii, odpowiedzialnych za rozwój zakażenia/choroby zakaźnej. Diagnostyka ta staje się niezwykle ważna w przypadku ciężkich zakażeń inwazyjnych, stanowiących bezpośrednie zagrożenie życia pacjenta. Dlatego zawsze należy dążyć do ustalenia czynnika etiologicznego zakażenia i jego wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki.

Metodami wykorzystywanymi w diagnostyce mikrobiologicznej zakażeń bakteryjnych są:

• bakterioskopia;
• hodowla z oznaczeniem wrażliwości na antybiotyki (posiew);
• badania serologiczne;
• badania molekularne.

Badania molekularne polegają na wykryciu materiału genetycznego drobnoustrojów – kwasu nukleinowego (PCR) jak i na analizie widm profili białkowych drobnoustrojów (spektrometria mas). Obecne tempo rozwoju i dostępności metod molekularnych, takich jak multipleksowe panele mPCR o szerokim spektrum, pozwalają na szybkie i jednoznaczne oznaczenie czynnika etiologicznego, a co za tym idzie na szybkie włączenie terapii celowanej. Nowe możliwości w postaci szybkiej i precyzyjnej identyfikacji drobnoustrojów po ich wyhodowaniu daje również spektrometr masowy typu MALDI-TOF. Metody „nowoczesne” cechuje przede wszystkim krótki czas oczekiwania na wynik w porównaniu z metodami klasycznymi, ale i duża czułość i automatyzacja. Metody te powalają również na diagnostykę po zastosowaniu leczenia przeciwbakteryjnego (analiza materiału z uszkodzonych i zabitych bakterii).

Pomimo ekspansji metod „nowoczesnych” metody klasyczne pozostają często metodami „gold standard” o dużej specyficzności i znajdują swoje ważne miejsce w diagnostyce klinicznej zakażeń.

Bakterioskopia to jedno z podstawowych badań w diagnostyce mikrobiologicznej, stanowiące zwykle jej początkowy etap, umożliwia szybką, dokonywaną w ciągu kilku/kilkudziesięciu minut, ocenę pod kątem obecności patogenu w badanej próbce. W barwieniu najczęściej stosuje się metodę Grama, dobór zastosowanej techniki zależy jednak od bakterii/drobnoustroju, będącego przypuszczalną przyczyną zakażenia. Barwienie metodą Grama jest najpowszechniej stosowaną metodą w laboratoriach mikrobiologicznych i stanowi podstawę klasyfikacji bakterii na Gram-dodatnie i Gram-ujemne, z uwagi na różnice w budowie ściany komórkowej tych bakterii. Obserwowany kształt, rozmiar oraz szczegóły strukturalne komórki stanowią wstępne, ważne wskazówki odnośnie rodzaju obecnych drobnoustrojów i sugerują, jakie dodatkowe metody można zastosować do ich scharakteryzowania. Stanowi ona ważny, pozwalający ukierunkować terapie empiryczna i tok diagnostyczny ciężkich zakażeń inwazyjnych, jak zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych.

Posiew jest podstawową i jedną z najważniejszych klasycznych metod stosowanych w diagnostyce zakażeń bakteryjnych. Polega on na przeniesieniu uzyskanego materiału od pacjenta na określone mikrobiologiczne podłoża, a następnie na hodowli zakończonej izolacją i identyfikacją wyhodowanych bakterii. Wyhodowanie drobnoustroju umożliwia nam przeprowadzenie diagnostyki każdą z dostępnych metod i wykonanie badania lekowrażliwości w celu ustalenia terapii celowanej dla pacjenta. Również i w tej metodzie obserwujemy postęp w postaci coraz szerszej gamy dostępnych podłóż selektywnych, różnicujących i chromogennych. Dzięki rozwojowi metod „nowoczesnych” coraz więcej wiemy o florze bakteryjnej naszego organizmu i umiemy dobierać odpowiednie podłoża oraz modyfikować czas i warunki hodowli bazując na tych danych („culturomics”).

Nadal, po wyhodowaniu, w identyfikacji ważnych patogenów człowieka klasyczne (manualne) metody biochemiczne stanowić mogą badanie rozstrzygające o końcowym wyniku badania. Przykładem jest test z optochiną i rozpuszczalnością w dezoksycholanie sodu dla pneumokoków zidentyfikowanych metodą spektrometrii mas. W większości przypadków jednak, współczesna diagnostyka mikrobiologiczna korzysta z automatyzowanych systemów zamkniętych, wykorzystujących testy biochemiczne (Vitek, Phoenix).

Badania serologiczne polegają na wykryciu obecności antygenów bakterii bądź przeciwciał, które mają zdolność wiązania się z określonymi antygenami. Są to klasyczne metody powszechnie stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej, pozwalające na bardzo szybką identyfikację czynnika etiologicznego, również bezpośrednio z materiału klinicznego, proste w wykonaniu i interpretacji. Czułość i specyficzność tych badań jest zróżnicowana, szczególnie dla testów lateksowych. Producenci tych testów podkreślają, że są one metodą przesiewową i powinny mieć charakter pomocniczy, jako wstępna diagnostyka bakteriologiczna. Każdy dodatni wynik testu powinien być potwierdzony, najlepiej posiewem bądź inną metodą diagnostyczną np. PCR lub preparatem. Jednakże i w tej grupie badań znajdziemy klasyczny test, wysoce specyficzny i oparty na reakcji polisacharydu otoczki bakteryjnej z specyficznymi przeciwciałami, służący do stereotypowania pneumokoków. Jest to tzw. Quellung reaction (reakcja pęcznienia otoczek, Neufelda) będąca „gold standard” metodą w serotypowaniu pneumokoków.